細胞冷凍保存的具體操作步驟

細胞冷凍保存的具體操作步驟
根據上海恒遠技術部給出的細胞冷凍保存方法，現公布于下：

細胞冷凍保存 

　　1. 注意事項：

　　1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態，約為80 – 90 %致密度。

　　1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

　　1.3. 注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP flon 過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。 1.4. 冷凍保存之細胞濃度：

　　1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。

　　1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

　　1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統方法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。

細胞冷凍保存 
　　2. 材料： 2.1. 生長良好之培養細胞 2.2. 新鮮培養基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)

　　3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養基中，zui后濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。

　　3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。

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