ELISA預實驗完整攻略

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）預實驗是開展正式實驗前不可少的環(huán)節(jié)，主要用于摸索合適的實驗條件及確定實驗的可行性。以下是ELISA預實驗的開展過程，一起來看看吧！

 

一、預實驗的目的

確定實驗條件：如抗原或抗體的濃度、酶的種類和濃度、洗滌液的濃度和pH值等，以確保實驗的準確性和可靠性。

確定實驗范圍：包括最佳反應時間和濃度范圍，以確保在正式實驗中獲得最佳的實驗結果。

驗證實驗方法：確保實驗方法的準確性和可靠性。

減少實驗誤差：提高實驗的重復性和可重復性。

 

二、預實驗的方法

 

1.實驗樣本的選擇：

預實驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實驗方案。通常，測定的樣本會分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理或刺激后，靶標物的表達量會產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機選擇1~2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數(shù)量多，分配到預實驗的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標物含量zui低組的樣品，另1例為理論上靶標物含量最高組的樣品。

 

2.最適稀釋倍數(shù)的確定：

①將樣本梯度稀釋，可根據(jù)樣本中靶標物的濃度，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋，同時測定標準品。

②標準品的制備需按照試劑盒說明書的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點（如空白孔、zui低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。

③將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的OD值（光密度值）與梯度濃度標準品OD值進行對比，最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部或絕大多數(shù)樣本OD值能夠位于標準曲線中間濃度孔對應的OD值，即標準曲線的最佳擬合區(qū)域。

④在做預實驗時，一定要設置標曲，不設置標曲則無法通過比較確定最適稀釋倍數(shù)。

 

3.抗原包被濃度的設定：

①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。

②以等量隨機選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應，在37℃孵育1小時后清洗，然后加酶標二抗，孵育30分鐘清洗，zui hou加底物顯色，反應終止后用酶標儀在450nm波長下測定各孔的光密度值。

③繪制ROC曲線（受試者工作特征曲線），找出臨界值。

 

4.酶標二抗稀釋比例的確定：

①取已知陽性和陰性血清樣本，分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標二抗溶液，與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色，zui hou用酶標儀測定光密度值。

②繪制ROC曲線，找出臨界值。

 

5.顯色時間的確定：

①顯色是ELISA實驗中zui hou一步溫育反應，固定在酶標板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。

②由于ELISA實驗會受到環(huán)境差異及實驗操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間，而是建議實驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應時間。

③加入底物后可定時觀察反應孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀察一次），當標準孔的前3~4孔有明顯的梯度藍色，后3~4孔梯度不明顯時，即可終止。通過預實驗熟悉操作的同時，也能確定合適的顯色時間。

 

三、注意事項

①在進行預實驗時，應嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，避免由于操作不當導致的實驗誤差。

②預實驗的結果應認真記錄和分析，以便為正式實驗提供可靠的依據(jù)。

③在預實驗過程中，如發(fā)現(xiàn)任何異?；虿环项A期的結果，應及時查找原因并進行調(diào)整。

 

通過以上預實驗的設置和操作，可以對ELISA實驗的條件進行初步的摸索和優(yōu)化，為后續(xù)的正式實驗提供可靠的基礎。同時，也能及時發(fā)現(xiàn)實驗中存在的問題，進行針對性的改進，提高實驗的準確性和可靠性。上海恒遠生物專業(yè)提供生命科學領域的技術服務，提供實驗技術服務，為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復勞動的時間和精力，我們有過硬的技術咨詢和完善的售后服務，購買ELISA試劑盒贈送免費代測服務，在線一對一技術指導，為您解決后顧之憂。